判断PCR扩增曲线是否正常

判断PCR扩增曲线是否正常，关键在于观察‌S型曲线‌、检查‌Ct值‌、分析‌熔解曲线‌并确保‌重复性‌。我来帮你拆解一下具体标准：
一、核心形态：S型曲线是金标准
正常的扩增曲线应呈现清晰的‌S型‌，包含四个阶段：
‌基线期‌：前10-20个循环，荧光信号稳定，仅略高于背景噪声。
‌指数期‌：信号急剧上升，这是定量分析的关键阶段。
‌线性期‌：扩增速度逐渐减慢，曲线趋于平缓。
‌平台期‌：试剂耗尽，信号不再显著增加。

‌理想曲线特征‌：拐点清晰、整体平滑、基线平整无上扬。

二、关键参数：Ct值与阈值线
‌Ct值‌：荧光信号达到设定阈值的循环数。‌合理范围通常为15-35‌：
‌Ct < 15‌：模板浓度过高，建议稀释。
‌Ct > 35‌：模板量过低或扩增效率差，需谨慎解读。
‌阈值线‌：应设在指数增长期的中部，仪器通常可自动设定。
三、特异性验证：熔解曲线分析
‌单峰‌：表明产物单一，特异性好。
‌多峰‌：提示存在非特异性扩增或引物二聚体。
四、重复性与对照
‌复孔重复性‌：同一样本的重复孔，Ct值差异应≤0.5个循环（上限1个循环）。
‌阴性对照‌：不应出现扩增曲线（Ct值应为40或无信号）。
‌阳性对照‌：应出现典型的S型曲线。